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自動化免疫分析精品(七篇)

時間:2023-06-07 15:46:32

序論:寫作是一種深度的自我表達。它要求我們深入探索自己的思想和情感,挖掘那些隱藏在內心深處的真相,好投稿為您帶來了七篇自動化免疫分析范文,愿它們成為您寫作過程中的靈感催化劑,助力您的創作。

自動化免疫分析

篇(1)

在醫學高速發展的今天,隨著先進技術的不斷引入,臨床醫學檢驗獲得日新月異的發展:高速度生化分析儀的裝備,解決不斷增長的檢測量的壓力;更靈敏的化學發光技術及后續研發投入,深刻地影響和拓展著免疫學檢測領域的廣度和深度;分子生物學技術、基因芯片、蛋白芯片技術的發展,必將會引領臨床醫學檢驗的全新變革,使得個性化的疾病診斷、治療成為現實。

全實驗室自動化(total laboratory automation,TLA)又稱全程自動化(front to end automation) 是將臨床實驗室中各種獨立的自動化儀器以特殊的物流傳送設備串聯起來,在信息流的主導控制下,構成流水線作業的組合,形成大規模的全實驗室常規檢驗過程的自動化,國內也有稱臨床實驗室自動化檢驗流水線。

基本結構:

1.標本運輸系統(sample transportation system, STS)

1.1傳輸系統負責將樣品從一個模塊傳遞到另一個模塊。

1.2現有的產品可分為兩大類: 智能化傳輸帶和智能自動機械臂,每一類中又有多種規格。

2.標本前處理系統(sample pre-analytical moudular system, PAM)

前處理工作站包括:

1.樣品分類

2. 自動裝載和樣本離心

3. 樣本去蓋

4. 樣本再分注及標記

3.自動化分析儀(automated analyzer)

4.分析后處理輸出系統

輸出緩沖模塊包括出口模塊和標本儲存接收緩沖區,出口模塊用于接收需人工復檢標本以及離心完畢的非在線檢測標本。標本儲存接收緩沖區可進行在線自動復檢,當LIS審核報告時,確認某一項目復檢后,即向該模塊發出復檢指令,將需要復檢的標本送入復查回路,并送至分析系統進行復檢。

5.臨床實驗室信息系統, (laboratory information system, LIS)

實時完成從醫院信息系統(hospital information system,HIS)下載患者資料、試驗請求信息、上傳標本在各模塊的狀態、標本架號位置、分析結果、通訊情況等。

全實驗室自動化(TLA)是將眾多模塊分析系統整合成一個實現對標本處理、傳送、分析、數據處理和分析過程的全自動化。標本在TLA可完成臨床化學、免疫學、血液學等亞專業的任一項目檢測。全實驗室自動化包括:自動化標本處理、標本自動傳送和分選至相應的分析工作站、自動分析、利用規范的操作系統軟件對分析結果進行審核、儲存已分析的標本并能隨時對儲存標本重新進行測試。

實驗室自動化流水線作為臨床檢驗醫學發展的必然趨勢,勢必對實驗室的管理和發展產生深遠影響。它的引入不僅是提高工作效率,減少實驗室運行成本,更重要的是建立一個實驗室標準操作平臺,提高了實驗室管理水平和服務質量,以高質量的檢測報告更好地服務患者,服務臨床科室,服務于醫院的長遠發展

參考文獻:

[1] Markin RS,Whalen SA. Laboratory automation: trajectory, technology, and tactics.Clinical Chemistry,2000,05.

[2]Sasaki M,Kageoka T,Ogura Clinica Chimica Acta,1998,02.

[3]Hoffmann GE.Concepts for the third generation of laboratory systems.Clinica Chimica Acta,1998,02.

篇(2)

【關鍵詞】 梅毒螺旋體; 血清學檢測; 化學發光; 核酸檢測

梅毒是國家規定的血液篩查的項目之一,在乙肝、丙肝、艾滋三個項目已經開始采用核酸篩查血液時,梅毒檢測現階段有哪些更好的方法可以用在血液篩查中提高血液篩查效果呢?最近20多年,隨著科學技術的迅速發展,梅毒的檢測方法與技術也取得了長足進步,不僅表現在檢測試劑的靈敏度和特異性不斷提高上,還表現在化學發光技術與核酸檢測技術(NAT)的引入。筆者現就梅毒螺旋體的實驗室檢測技術做一評述。

1使用類脂質抗原的梅毒螺旋體

血清學檢測技術\[1\]此類試驗主要包括VDRL、USR、RPR、TRUST等,其中VDRL和USR需要使用顯微鏡觀察結果,RPR和TRUST用肉眼觀察結果。

1.1VDRL(性病研究實驗室試驗)

20世紀50、60年代最為常用的梅毒血清學試驗。反應素(梅毒螺旋體破壞機體組織過程中,機體產生的相應抗體)與抗原(從牛心中提取的心磷脂和從雞蛋黃中提取的卵磷脂及膽固醇等有效成分)發生反應,試驗時的搖動,使得反應素與抗原反應,形成的顆粒互相粘附,形成顯微鏡下可見的凝集沉淀,即為陽性。VDRL試驗有幾個缺點,即抗原需要每日配置;血清標本需加熱滅活;要在顯微鏡下觀察結果。因此,后來又推出了改良的USR和RPR。

1.2USR(不加熱血清反應素試驗)

本方法對VDRL抗原進行了改良,即將VDRL抗原稀釋后,再將抗原懸液離心,然后在沉淀物中加入含有EDTA-Na2即氯化膽堿等的緩沖液。EDTA可使抗原半年內不變性,氯化膽堿可以滅活補體,這樣就無需每天配置抗原,也無需血清加熱滅活,但仍需顯微鏡下觀察結果。

1.3RPR(快速血漿反應素環狀卡片試驗)

本方法是在USR抗原的基礎上,加入特制的活性炭顆粒,這樣,抗原抗體反應呈現出黑色的凝集顆粒,在白色紙片上,肉眼易于觀察。

1.4TRUST(甲苯胺紅不加熱血清試驗)

本方法是在前述抗原試劑中加入了甲苯胺紅。甲苯胺紅是一種顆粒均勻的化學染料,陽性結果呈現出紅色的凝集顆粒,更加便于觀察。目前,用于梅毒篩查的常用方法是TRUST和RPR。

上述4種試驗都使用類脂質抗原,采用凝集反應方法測定,操作簡單快速,但4種方法的特異性較差。多種疾病如類風濕關節炎、紅斑狼瘡等,會出現生物學假陽性。有報道在沒有梅毒感染史的正常人群中上述實驗會有0.1%的陽性率。TRUST方法曾經用于血液篩查,但從2000年起逐漸停用,取而代之的是靈敏度和特異性更高的酶免方法。

2使用密螺旋體抗原的梅毒螺旋體

血清學檢測技術此類試驗是梅毒特異性抗體檢測試驗,比較常用的有如下幾種。

2.1TPHA(梅毒螺旋體血球凝集試驗)

本實驗是以梅毒螺旋體作為抗原的間接血細胞凝集試驗。所用抗原為將梅毒螺旋體nichols株經超聲裂解后得到的可溶性抗原成分,用其致敏火雞或羊紅細胞,然后用Reiter株(無毒株)制成的吸收劑稀釋血清,吸收血清中的非特異性抗體。經過上述處理后TPHA試劑的特異性和敏感性均較高。本試驗無需特殊設備,尚未實現自動化檢測,試驗中可發生自凝現象,需引起重視。由于TPHA試劑成本較高,且不能實現批量自動化檢測,因此本方法暫不適合用于血液篩查。

2.2TPPA(梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗)

本實驗原理與TPHA類似,其所用凝集顆粒為明膠顆粒而非紅細胞。TPPA在2002年為美國疾病預防控制中心推薦用作梅毒確證試驗,其靈敏度和特異性均較高,但試劑價格較貴。據文獻報道,TPPA與ELISA檢測結果之間符合性很好\[2,3\]。

有報道稱TPPA試驗可以實現自動化檢測\[2\],但未見TPPA試驗自動化的明確報道。TPPA的自動化檢測也是筆者科研立項的題目。如果TPPA可以實現自動化檢測,那本方法是很適宜用作血液篩查的。應用TPPA作為血液篩查方法其意義不僅在于它是一項確認試驗,還在于進行獻血者告之時給予肯定的結果,從而避免引起各種糾紛。

2.3ELISA(酶聯免疫吸附試驗)

本方法所用試劑經過十余年的發展,現采用基因工程的方法,得到高純度的梅毒螺旋體外膜蛋白作為抗原,大大提高了試劑的特異性。用于檢測TP的IgG和IgM抗體。大量的試驗表明其與TPPA,TPHA有較好的相關性\[2,3\]。本試驗操作簡單,可實現自動化檢測,是梅毒血清學診斷試驗的首選方法。現階段血液篩查要求使用兩個不同廠家生產的試劑進行篩查,本方法應用已經十分成熟。

2.4金標法

本法是以基因工程生產重組純化的TP外膜蛋白,采用膠體金標法和免疫層析技術進行TP抗體的檢測,該方法快速,簡便,但有假陽性的結果,需做進一步的確認試驗。本方法主要用于街頭血液TP的快速篩查。

2.5FTA-ABS(熒光螺旋體抗體吸附試驗)

本試驗為定性試驗,是公認的“經典”血清學試驗。它是將Nichols株抗原涂在玻片上,然后用Reiter株制成吸收劑加入待測血清中,30min后將混合血清加在涂有抗原的玻片上37℃孵育30min,然后用PBS緩沖液沖洗晾干,加上熒光素標記的抗人IgG,37℃孵育后沖洗晾干,最后用熒光顯微鏡觀察結果。由于本試驗需要熒光顯微鏡,以及不能進行自動化檢測,因而不適合應用于血液篩查中。

2.6WB(蛋白印跡技術)

20世紀80年代蛋白印跡試驗逐漸發展起來,它是一種膜上免疫測定技術。首先將梅毒螺旋體Nichols株菌體細胞用超聲波破碎,再使用聚丙烯酰胺凝膠電泳將梅毒螺旋體各種抗原成分分開形成不同區帶,經電轉印可將這些條帶轉移到硝酸纖維素膜上作為抗原,最后用酶標技術檢測病人血清中的相應特異抗原。如果出現特異性區帶15.5KD和45KD,這時即可確診梅毒。這種方法通常作為篩查陽性標本的確認試驗。RPR, FTA-ABS,和TPHA,TPPA等試驗出現的假陽性,用本實驗檢測均為陰性,有研究表明本方法要優于上述這些方法,是一種很不錯的確認試驗。

3化學發光免疫分析法

本法是化學發光法和免疫分析法結合的產物,是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合,它采用化學發光反應試劑標記抗原或抗體,等其與待測物經過一系列反應后,測定發光強度以確定待測物的含量。該方法廣泛用于各種抗原、抗體、酶、藥物等物質的檢測,是一項最新的免疫測定技術\[4\]。在檢測梅毒抗體方面,三甲醫院臨床實驗室逐漸采用化學發光免疫分析儀進行檢測,在近幾年的文獻中多有報道,其結果與TPPA、ELISA等符合性較好\[5,6\]。由于其自動化程度高,檢測快速,靈敏度特異性與TPPA持平或更高\[5\],因此在血液篩查檢測中也是一個很好的選擇,其唯一不足之處在于檢測成本較高。

4PCR(聚合酶鏈反應)

經過持續不懈的努力,對于梅毒螺旋體的基因結構已經清楚\[7\],是由1,138,006個堿基對組成的環狀DNA鏈,有1041個開放讀碼框架,已經發現TP膜抗原有22種,內鞭毛蛋白36種,其中外膜蛋白47KD蛋白和內鞭毛37KD蛋白具有高度免疫原性。以下就常用PCR的方法做一介紹。

4.1常規PCR

常規PCR首先要選取適宜的靶基因進行擴增。早在1990年,國外有學者使用tmp基因作為靶基因來設計相應引物,之后又曾嘗試過bmp、47Kda等基因,但效果均不理想。2000年時,經研究比較發現,polA基因具有較高的特異性和敏感性\[8\],隨后將其用于引物設計。經過臨床試驗驗證,其敏感性和特異性達到95.8%和95.7%,效果顯著。常規PCR后期工作比較繁瑣,因其需要做凝膠電泳。本試驗需要重點控制的環節是防止擴增產物受到污染。

4.2多重PCR

本方法在常規PCR的基礎上進行了改進。在使用靶基因作為引物設計上采用了多個特異性抗原基因設計多個引物同時擴增幾條DN段。試驗的反應原理、反應試劑、操作過程都與常規PCR一樣。有學者應用多重PCR檢測梅毒螺旋體感染者的標本后再與確認PCR比較,其一致率達99.3%,而且該方法很適合在常規實驗室使用\[9\]。

4.3實時熒光定量PCR\[10\]

本方法是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用對熒光信號積累的實時檢測來監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。Holland及其同事最早提出了TaqMan原理\[11\]。利用這一原理,設計出了TaqMan熒光探針,使用實時熒光PCR儀實時檢測熒光信號。在TaqMan熒光探針的基礎上,進一步又發展了MGB探針\[12\]。我國學者徐瑾等構建了重組質粒PMD18-T-TP,建立了利用MGB-Taqman探針的實時熒光定量PCR\[13\]。幾年之后,Leslie等使用改進的實時熒光定量PCR與血清學方法比較,結果Real-Time PCR的敏感性和特異性均較高。與常規PCR相比,實時熒光定量PCR不僅不需要電泳確證,因其采用閉管熒光檢測,還大大減少了假陽性。實時熒光定量PCR的過程自動化程度高,其高靈敏度和特異性也使其廣泛應用于醫學檢測的各領域。

4.4巢式PCR

又稱二次PCR,也即進行兩次擴增。本方法首先用外引物進行第一輪PCR,利用第一次擴增的DNA序列內部的一對引物再次擴增。有報道稱巢式PCR可檢測1.6fg的TP DNA,因此適用于檢測血清等標本中微量的梅毒螺旋體。多名學者設計試驗對巢式PCR與常規PCR、血清學方法進行比較\[14\],實驗結果顯示巢式PCR與血清學方法無顯著性差異,但與常規PCR有顯著性差異。由于巢式PCR使用了兩對引物進行了兩次擴增,其敏感性和特異性均得到了增強,故可以作為血清學方法的補充用于梅毒螺旋體的診斷。

4.5逆轉錄PCR(RT-PCR)

本方法首先是提取目標細胞中總RNA,利用mRNA做為模板,反轉錄生成cDNA,然后將cDNA做為模板擴增,即可獲得目的基因。雖然檢測結果優于常規PCR,但其操作較常規PCR繁雜,注意事項較多,故不利于推廣使用。

梅毒是一種由蒼白密螺旋體引起的傳染病,最近幾年發病率逐年上升,這種情況對輸血安全構成了嚴重威脅。實驗室檢測梅毒的方法較多,梅毒研究中常使用WB、TPPA和PCR三種方法;臨床實驗室常用的方法有ELISA、TRUST、TPPA、化學發光法等\[15\];血液篩查是使用不同廠家的兩種ELISA試劑進行。為了提高血液篩查水平,根據不同實驗的特點,建議在血液檢測中使用TPPA或化學發光法篩查梅毒,以便更好的保證輸血安全。

參考文獻

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\[7\]Fraser CM,Norris SJ,Weinstock GM,et plete genome sequence of treponema pallidum,the syphilis spirochete. Science,1998,281(5375):375-388

\[8\]Rodes B,H Liu,S Johnson,et al.Cloning and characterization of a gene polA coding for an unusual DNA polymerase Ⅰ from the obligate parasite Treponema pallidum.J Med Microbiol,2000(49):657-667.

\[9\]Mclver CJ, Rismanton N,Smith C,et al.Multiplex PCR testing detected higher than expected rates of cervical Mycoplasmas,Ureaplasmas,Trichomonas and viral agents in sexually active Australian women .J Clin Microbiol,2009,47(5):1358-1363.

\[10\]李金明.實時熒光PCR技術.北京:人民軍醫出版社.2012:17-18.

\[11\]Holland PM,AbramsomRD,WatsonR,et al.Detection of spesific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.Proc.Natl Acad.Sci.USA,1991,88:7276.

\[12\]Afonina IA,Reed MW,Lusby E,Shishkina IG,et al .Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by hybridization-triggered fluorescence.Biotechniques,2002,32(4):940.

\[13\]徐瑾,張順.梅毒螺旋體熒光定量PCR檢測方法的建立和初步臨床應用.江西醫學檢驗,2005,23(6):529-532.

\[14\]曾鐵兵,吳移謀,黃澎杰,等.巢式PCR擴增梅毒螺旋體polA及其臨床應用的研究.中國皮膚性病學雜志,2004,18(2):74-76.

篇(3)

關鍵詞:ADVIA Centaur XP;ARCHITECT i2000SR;比對試驗

0 引言

隨著國內化學發光免疫分析技術的不斷成熟,化學發光免疫檢測系統在臨床上應用逐漸廣泛?,F對我院引進的ADVIA Centaur XP和ARCHITECT i2000SR化學發光免疫分析儀在甲狀腺激素檢驗中進行比較分析,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月至2013年2月我院內分泌門診和住院送檢的120例甲狀腺功能測定血清標本作為研究對象,其中低值40例,中值40例,高值40例。質控物為Bio-RAD質控血清,批號分別為40231、40232和40233[1]。使用儀器為ADVIA Centaur XP全自動化學發光免疫分析儀(西門子)和ARCHITECT i2000SR全自動化學發光免疫分析儀(雅培)及其配套試劑、標準品。

1.2 方法

對本組120例樣品先后使用ADVIA Centaur XP和ARCHITECT i2000SR檢測,記錄檢測數據。2臺儀器均每日檢測Bio-RAD質控血清在控[2]。將ARCHITECT i2000SR作為參考儀器(作為坐標軸X),按照ADVIA Centaur XP定標液濃度配制血清作為標準品對ADVIA Centaur XP(作為坐標軸Y)進行校正,再次比較分析檢測結果[3]。

1.3 評價標準

參照澳大利亞室間質量評價標準以t±1.5s或t±15%為日間CV可允許范圍;以系統誤差(SE%)

1.4 統計學處理

所有數據均使用 SPSS17.0 數據分析軟件進行統計學處理,差異性比較采用t檢驗,進行可靠性分析、相關性分析和回歸分析,以P

2 結果

兩臺儀器不同Bio-RAD水平質控物游離三碘甲腺原氨酸(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)和促甲狀腺素(TSH)檢測結果顯示3批質控物的日間CV及總CV均0.970。

由于ARCHITECT i2000SR質評成績優秀且進行定期校準因此在研究中作為目標系統,ADVIA Centaur XP自配校準后,兩臺儀器檢測結果差異無統計學意義(P>0.05),FT3及FT4檢測結果均被臨床接受(見表3)。

3 討論

ADVIACentaur XP和ARCHITECT i2000SR均為臨床常用化學發光免疫分析儀,由于兩種儀器系統均采用順磁顆粒和磁性分離技術,自動化程度和準確性都較高,能夠測定包括內分泌激素、血藥濃度、心血管疾病標志物、過敏原、腫瘤標志物以及免疫學各項指標等項目[5]。本組研究結果顯示兩臺儀器在不同Bio-RAD水平質控物水平上日間CV及總CV均

參考文獻:

[1] 王治國. 臨床檢驗質量控制技術[M]. 北京: 人民衛生出版社, 2004: 38-54.

[2] 龔智仁, 曹春曉, 楊琦, 等. ADVIA Centaur XP與ARCHITECT i2000SR化學發光免疫檢測系統的比對試驗[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2012, 33(04): 467-469.

[3] 譚云昌, 曾正蓮. 不同品牌化學發光儀檢測甲狀腺激素的相關性分析[J]. 檢驗醫學與臨床, 2010, 07(15): 1622-1623.

篇(4)

【關鍵詞】 化學發光免疫分析技術;基本原理;分類;應用

近10多年來,當代生物技術的研究和應用取得高速發展的同時,也大大推動了化學發光免疫分析方法(CLIA))的更新換代速度?;瘜W發光免疫分析法(CLIA)是建立在放射免疫分析技術(RIA)理論的基礎上,以標記發光劑為示蹤物信號建立起來的一種非放射標記免疫分析法,具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單、操作方便、分析速度快和容易實現自動化和不污染環境等優點,特別是能在較短的時間內得到實驗結果,因此深受檢驗醫學工作者和臨床醫師的好評。

1 化學發光免疫分析的原理

化學發光免疫分析技術的基本原理,化學發光免疫分析含有免疫分析和化學發光分析兩個系統[1]。免疫分析系統是將化學發光物質或酶作為標記物,直接標記在抗原或抗體上,經過抗原與抗體反應形成抗原-抗體免疫復合物?;瘜W發光分析系統是在免疫反應結束后,加入氧化劑或酶的發光底物,化學發光物質經氧化劑的氧化后,形成一個處于激發態的中間體,會發射光子釋放能量以回到穩定的基態,發光強度可以利用發光信號測量儀器進行檢測[2]。根據化學發光標記物與發光強度的關系,可利用標準曲線計算出被測物的含量。

2 化學發光免疫分析的分類

化學發光免疫分析根據應用發光體系應用于免疫分析中的方式不同可分為直接標記發光物質的免疫分析,酶催化化學發光免疫分析,電化學發光免疫分析(ECLIA)。直接標記發光物質的免疫分析,目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學發光劑。

3 化學發光免疫分析的臨床應用

CLIA已廣泛應用于基礎和臨床醫學的各個領域,成為替代RIA的首選技術。Amersham公司針對AmerliteTM發光增強酶免疫分析系統研制出的試劑盒項目有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素,與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮,以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。Amersham公司雖然研制出這10余種試劑盒,但因操作不夠簡便,檢測項目僅限于蛋白質類大分子化合物,未能廣泛應用于臨床醫學檢測。

美國Ciba Corning公司研制的ACS:180自動CLIA系統能非常精確測量閃光。經過不斷的改進,實現了ACS:180CLIA系統的全自動化,推出全新產品"ADVIA系列"?,F有檢測項目47項,更多的項目還在開發之中。主要有甲狀腺系統、性腺系統、血液系統、腫瘤標記物、心血管系統、血藥濃度及其他一些檢測項目。

經過改良后,金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下可發出高強度的輝光,光信號可持續1~2 h。隨后國外生產廠家研制出以堿性磷酸酶為標記物的試劑盒,與之相匹配的有DPC的IMMULITE全自動CLIA系統和Beckman的ACCESS全自動微粒子CLIA系統。IMMULITE全自動CLIA系統可檢測項目有心臟病、甲狀腺功能、性腺激素、傳染病、藥物、血清學、血液病、成癮藥物、糖尿病、過敏檢測和腫瘤標志物。ACCESS全自動微粒子CLIA系統主要可檢測甲狀腺功能、血液系統、內分泌激素、藥物、腫瘤因子、心血管系統和糖尿病等項目。

目前商品化的ECLIA分析系統只有Roche公司的ECLIA全自動分析系統。主要特點是本底信號極微,特異性更高,最小檢出值可達1 pmol以下,操作十分簡便快速,是CLIA優點較為集中的完美分析技術。已提供試劑盒的項目有腫瘤標志物、甲狀腺功能、內分泌、傳染病、心肌標志物和維生素類等項目。

王陽[3]運用了電化學免疫分析技術,檢測了3種腫瘤標志物癌胚抗原(Carcinoem-bryonic Antigen,CEA)、細胞角蛋白l9片段(Cytokeratin 19fragments,CYFRA21,1)和神經元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)水平,對肺癌診斷有實際應用價值。張忠英[4]等利用電化學發光免疫分析技術檢測尿CK19片段,結果顯示尿CK19檢測對膀胱癌等泌尿系統腫瘤診斷和復發監測具有敏感性高、無創傷性的優點,優于血清CK19和尿細胞學檢查。動態觀察尿CK19片段含量的變化可降低急性尿感患者的假陽性率。王利娜[5]等應用ECLIA測定和酶免疫測定(EIA)檢測乙肝標志物。結果:應用ECLIA方法檢測HBsAg精密度,最大批內變異≤8.30%,最大日間變異≤15.33%,HBsAg靈敏度0.05 ng/ml,HBeAg靈敏度0.03NCU/ml。HBsAg檢測范圍0.01~7 000 COI。顯示ECLIA檢測HBsAg靈敏度高,重復性好,檢測范圍寬。檢測HBeAg靈敏度可能更高。李錦洲[6]等采用ECLIA法對卵巢癌、良性卵巢腫瘤及健康婦女血清CA125分別進行測定,ECLIA用于第二代CA125(CA125-Ⅱ)測定,使CA125測定更加敏感恒定,每日之間差異較小。黃琛,湯漢紅等[7]在ECLIA法檢測與蛋白質芯片法多腫瘤標志物結果差異的研究中顯示:兩種方法有較好的相關性(P

化學發光免疫分析技術在醫學的臨床應用已非常成熟,有取代放射免疫分析技術和酶聯免疫分析技術而成為診斷市場上的主流產品的趨勢。國外的化學發光免疫分析檢測系統價格昂貴,普及有一定的困難;國內的化學發光免疫分析檢測系統雖然價格較國外產品便宜很多,但其檢測的靈敏度和可靠性,還有待進一提高。研究者在如何提高免疫診斷的敏感性和特異性、發展新的分析體系和檢測技術便攜化等方面仍需要不斷努力。

參 考 文 獻

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【關鍵詞】 臨床檢驗;應用;化學發光免疫技術

化學發光免疫技術具有標本用量較少、穩定性較高、標記物制備較容易、不污染環境、操作簡便以及便于實現自動化等優點,主要將免疫分析與化學反光分析相結合,被廣泛應用到臨床醫學和基礎醫學中?;瘜W發光免疫技術是繼酶免疫、發射免疫以及熒光免疫測定之后的免疫技術,在臨床檢驗中經常需要檢測和分析表征性物質,以判斷疾病以及身體病理特征[1]。通過在臨床檢驗中應用化學發光免疫技術,快速分析各種物質,能夠提高檢測的靈敏度與準確度。

1 化學發光免疫技術的概況

化學發光免疫技術主要包括化學發光分析和免疫分析系統,用于抗原、抗體、酶、激素、維生素以及脂肪酸等檢測分析技術。化學發光分析是根據免疫反應情況,待免疫反應完之后加入酶或氧化劑等發光底物,發光底物經過氧化會形成處于激發狀態的中間體,通過發射光子來釋放能量,以達到穩定狀態。而免疫分析是在抗體或抗原之上利用標記物進行直接的標記,標記物為化學物質或酶,待抗體或抗原發生反應后,會產生帶有抗體免疫的復合物。

化學發光免疫技術的原理是以化學發光劑對抗體或抗原進行直接標記,待磁顆粒性、抗體或抗原發生反應之后,在磁場的作用下,分離處于游離狀態和結合狀態的化學發光劑,將發光促進劑加入到結合狀態的部分,使其進行快速的發光反應,并以定性或定量的方式檢測處于結合狀態的發光強度?;瘜W發光免疫技術系統具有操作較為簡單,結果較為準確可靠,且自動化程度較高以及試劑儲存的時間較長等優點,可根據激發態分子能量的來源,將化學發光的過程分為生物發光、光照發光和化學發光。

2 化學發光免疫技術在臨床檢驗中應用的類別

化學發光免疫技術在臨床檢驗中,主要分為酶催化化學發光的免疫分析、直接標記發光物質的免疫分析以及電化學發光的免疫分析。酶催化化學發光的免疫分析是通過抗體或抗原在標本中發生反應之時,采用發光的酶作為標記物。直接標記發光物質的免疫分析是采用吖啶酯對體或抗原進行直接標記,待抗體或抗原發生免疫反應后會產生一種復合物,加入氫氧化鈉和帶有雙氧水的氧化劑后呈堿性,出現發光、分解等現象[2]。而電化學發光的免疫分析過程包括化學反光和電化學,將三丙胺作為電子供體,對抗體或抗原用三聯吡啶釕進行標記,在電場的作用下,通過電子轉移而產生發光反應。

3 在臨床檢驗中應用化學發光免疫技術的分析

3.1 應用化學發光免疫技術分析傳染性疾病 乙型肝炎病毒是血清學的標志物,是治療和評價機體免疫功能的重要指標。診斷乙型肝炎病毒中的抗體或抗原的表面部分是否受到感染,這樣的診斷為常規酶法,但常規酶法會使低病毒含量的攜帶者出現漏檢的情況。化學發光免疫技術和以前的常規酶法相比,具有線性范圍寬和高靈敏度等特點,在臨床檢驗中應用化學發光免疫技術對傳染性疾病進行分析,如對于已感染免疫病毒的兒童,應對其體內的甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒以及單純皰疹病毒以Bowser等進行測定,檢測出的靈敏度較高。

3.2 應用化學發光免疫技術分析腫瘤標志物 腫瘤標志物指腫瘤腫瘤在發生與增殖的過程中,通過腫瘤細胞進行合成、釋放或者是機體與腫瘤細胞發生反應,產生酶、激素、白質以及癌基因產物等物質。患者的細胞、血液以及組織中都會有腫瘤標志物,利用化學發光免疫技術能夠快速的尋找到難以發現的腫瘤標志物。通過對患者進行體外的輔助診斷以及術后監測,能夠緩解患者的病痛。采用Mac等診斷和監測食管癌患者的病情,如對血清中的癌胚抗原濃度、鱗狀細胞癌的抗原濃度等進行檢測。以Raslan和Shabin對健康孕婦德陰道液和胎膜早破中的人絨毛膜促線性激素和AFP標志物進行比較,AFP的特異性和敏感度較高。

3.3 應用化學發光免疫技術分析心臟疾病 在臨床檢驗中,經常以同丁酶對心臟疾病患者進行定量測定。心肌損傷的標志物包括肌酸激酶、肌紅蛋白和肌鈣蛋白T,應用化學發光免疫技術分析心臟疾病的標記物,能夠提高檢測的準確度。通過采用Dutra等將肌鈣蛋白T(cTnT)的受體分子制成免疫傳感器,應用于早期心肌梗死的臨床檢測,其方法較好,具有相關性,可以應用到臨床中對標本進行檢測。

3.4 應用化學發光免疫技術分析激素 激素是細胞和細胞間進行信息傳遞的媒介,主要指散在內分泌細胞中或內分泌腺所分泌出來的高效能的活性物質。在臨床檢測中應用化學發光免疫技術分析和測定性激素、甲狀腺激素等激素,能夠為臨床診斷和治療提供比較可靠、準確的實驗室數據,提高檢測的靈敏度和特異性[3]。通過以Vutyavanich等對血清中的促黃體生成素、素、促卵泡生成素以及催乳素等進行檢測,以Karlsson對患者甲狀旁腺進行檢測,以Gayk和Schmidt對骨代謝標志物中的降鈣素進行測量,并和放射免疫法相比,其精密度和準確度較高。

3.5 應用化學發光免疫技術分析其他物質 在臨床檢驗中,應用化學發光免疫技術還可以分析細菌、維生素、免疫球蛋白、細胞因子、酶以及基因等。通過Dasgupta等對血清中高辛含量進行檢測,以Quan等對食物中含有的鹽曲霉毒素B1進行檢測。

綜上所述,化學發光免疫技術具有不污染環境、操作簡便以及便于實現自動化等優點,被廣泛應用到臨床醫學和基礎醫學中。在臨床檢驗中應用化學發光免疫技術,能夠為臨床檢驗提供數據依據,提高檢測的精密度和準確度。

參考文獻

[1] 施麗娟.發光免疫分析技術及在臨床檢驗中的應用[J].檢驗醫學與臨床,2012,6(4):57-58.

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【關鍵詞】實驗室;自動化檢測;管理;培訓

【中圖分類號】R185 【文獻標識碼】B 【文章編號】1005-0515(2011)07-0313-01

目前,九江市中心血站必須檢測項目為:血紅蛋白、HBsAg、抗-HCV、抗-HIV(1+2)、抗TP、ABO血型正反定、RH(D)血型,另外我站還開展了ABO、RH血型效價的檢測,吸收放散實驗等項目。并對臨床用血進行臨床咨詢與督導。

1 依據

嚴格按照《獻血法》、《血站管理辦法》、《血站質量管理規范》和《血站實驗室管理規范》要求,制定嚴格的管理制度和實驗室檢測程序。不斷改進,提高血站的自動化檢測管理水平,使病患者使用合格、放心的血液,創立血站的品牌效應。自2008年,我站通過了ISO9001:2000國際認證,并每年由認證公司來進行認證,2010年正式升級為為ISO9001:2008版認證,同時培養了一批內審員,并進行考核獲得了上崗證。實行內審員輪流對從血液采集到血液的發送整個操作流程進行審核,每年還進行質量審核。在現有工作程序的基礎上,不斷提出問題、發現問題、解決問題,不斷推進改革與創新。

2 人員素質

對每位新進入員工,由資深工作人員帶教,經過培訓合格,并取得國家規定的血站工作人員上崗證,而HIV的檢測必須要求持有全省HIV培訓結業證才能獨立操作HIV的檢測并有簽名權。對報告的最終判定及發送,必須由經過培訓及授權的人員審核整個實驗過程反復核對后才能最終將結果發送至供血科,供臨床使用。

還要求每位員工必須每年有75課時的培訓,年初制定出每月的培訓計劃,不斷的完善工作中的不足,對已發生的錯誤要求開科室質量會議全科人員共同探討原因,并分析原因及時提出預防措施,提高工作效率。對檢測過程中存在的不足,共同討論尋求最佳處理方法。

3 設備與儀器管理

建立和實施儀器設備的確認,維護、校準、備案等制度,必須具有唯一的標識專人專管。每日做好儀器的維護、保養,每月專人進行全面維護、保養,另對關鍵設備要先進行確認有備用設備及緊急預案措施,并要求有UPS電源。關鍵設備有公司、工程師定期校準。硬件方面:1998年,已由國家配發了一臺RSP加樣儀,2003年,我站首次購買了FAME16/20;全自動酶免檢測系統,完成了從進板到加樣、洗板、孵育,讀板等程序的自動化檢測過程。2009年,我站投入大量資金嚴格按《病原微生物實驗室生物安全管理條例》要求升級改造實驗室。自2006年以來,我站已完成了血型自動化檢測的模式,避免了人為誤差,血型檔案從無原始檔案發展為有資料可循,與免疫結果一樣具有可追溯性。到2009年,我站由于采血量的加大,不能滿足我站的檢測要求,又增加了一臺FAME24/30與加樣儀STAR,這樣使我站的檢測真正做到同一標本,不同的試劑,不同的工作人員,不同的儀器設備進行檢測,降低了漏檢發生的可能性。在2009年我站在全省第二個運用了實驗室結果及質量檢測軟件Liswell,這樣從標本的交接、檢測、結果、標本保存、銷毀、都有一套完整的記錄程序,并對每個過程都以書面形式保存和備份,真正實現實驗室的自動化、標準化、現代化管理。且對每日的結果數據備份成光碟,定期交檔案是存檔。并于2010年新引進了日立全自動生化分析儀,運用速率法更準確的檢測ALT。

4 試劑與標本處理

所用試劑必須經國家認可,經質檢部門及本站質控科確認合格的試劑,使用前將試劑放于室溫平衡半小時,使用前檢查試劑的完整性,并按比例配制試劑等,并將實驗室溫度嚴格控制在18-25。C,45%-80%。

九江市現用試劑部分為進口試劑,這樣有效縮短了窗口期,對提高病人的用血安全和工作人員自我保護起到了一定作用。并嚴格執行試劑的保存、出入庫、交接手續等制度。在標本處理完畢后,按順序將標本放置全自動加樣儀,按先加酶免,再加血型的原則,因免疫加樣儀為STAR一次性加樣尖,而血型加樣為RSP加樣儀,而血型加樣儀為反復加樣針,以此避免標本的污染。

血液的標本在本站目前還是一個標本做多個項目,在本實驗室要求5ML+1ML的標本量,并要求在外采血后針頭不拔出試管,并在檢驗科標本交接時仔細核對試管上的條碼與血辮上的條碼是否一致,避免張冠李戴現象。觀察血標本的外觀,有無溶血,脂血的異?,F象,如發現任何問題,填寫標本返工單,要求外采人員重新取樣,確保標本符合各檢驗項目的要求。

5 操作流程要求

對檢驗科免疫項目的檢測原始記錄,整個實驗操作步驟精確到每分每秒,保證有據可依,所有相關記錄做到”做我所寫,寫我所做。確保檢測項目、實驗步驟、檢測結果的準確性和可靠性,具有可返溯性。同時,還實行了嚴格的檔案管理制度,定期進行總結、整理、匯總、歸檔。

參考文獻

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[2] 衛生部:血站實驗室質量管理規范[S].2006年,183

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1 SELEX技術簡介

1. 1篩選過程

SELEX技術依據分子生物學的原理,首先人工構建一個隨機寡核苷酸文庫,隨機核苷酸序列的長度為20-40bp左右,所包含的不同種立體構象,幾乎可以涵蓋自然界存在的所有種類的靶分子。將靶標物質與隨機文庫在一定條件下進行混合,形成文庫洋巴標復合物,把未結合的核酸洗脫掉,富集與靶物質結合的核酸分子,以后者為模板進行PC R擴增,得到的產物經分離純化后,作為進行下一輪篩選的模板。如此反復,通過多輪(8-15輪)篩選,與靶標不結合或親和性弱的核酸分子被充分去除,而與靶分子親和性強的核酸分子被分離出來,同時其純度隨著篩選輪數的增加而增加。最后篩選到的文庫要經過克隆測序和特異性修飾,經過這些步驟后,所獲得的特異識別靶分子的核酸才是適配體。

1.2優勢和特點

1)親和力高、特異性強。適配體與靶標之間,憑借彼此互補的三維結構,相互作用后形成牢固穩定的復合物,其解離常數通常能達到pmol/L-nmol/L的水平,并且能分辨出靶標結構上細微的差別。

2)庫容量大,識別范圍廣泛。SELEX技術的靶標遠遠多于經典的抗原抗體結合反應,除了有蛋白質、核苷酸分子外,還可以是糖類、氨基酸、維生素、抗生素、金屬離子、有機染料,甚至可以是細菌、病毒、寄生蟲等完整的細胞或組織,幾乎囊括了自然界中的全部物質。

3)合成容易,獲得方便,易于修飾。適配體的體積比傳統抗體小,篩選過程簡便、周期短,對實驗室的要求不高,并具備自動化控制的巨大潛力。經過化學合成和修飾以后可保持原生物活性不變,還可以增強其穩定性并增加其他新的化學性質,參加多類反應。標記了熒光、生物素和納米金顆粒之后,發展出了諸如分子成像技術等疾病診斷新方法。

4)重復性好,純度高。整個篩選和制備的過程在人為控制之下,所得到的適配體幾乎沒有生產批次之間的差異,便于日后的大規模生產和應用。

5)分子量小、穩定性高。相對于抗體或酶,適配體的化學性質更穩定,不易降解,對溫度不敏感,保存時間長,即使變形也能在很短的時間內復性,利于室溫下運輸。

6)應用便捷。SELEX技術所獲得的適配體又被稱作是核酸型抗體,其優于傳統抗體的性質是沒有免疫原性,因此便能獲得一些低免疫原性甚至無免疫原性靶分子的適配體。并且還省去了傳統抗體制備過程中的動物實驗,而直接從體外文庫中獲取。而且適配體更容易通過細胞膜,并且沒有毒性,利于檢測細胞內的靶分子和實現多層次的調控,并能較快地被機體清除代謝掉,經過特定的化學修飾后,還可使半衰期延長,穩定性提高,便于科學研究和疾病診治。

2 SELEX技術的發展

目前SELEX技術出現了一些新的篩選方法,越來越多的與各種標靶相對應的適配體被篩選出來。如毛細管電泳法、硝酸纖維素膜過濾法、磁珠分離法、親和色譜法、Non SELEX技術、無引物PCR SELEX技術、微流體SELEX技術、生物芯片SELEX技術、原子力顯微鏡等各種新的模式也被應用到適配體的篩選中。同時還出現了SELEX技術與定量PCRSEL-EX技術與流式細胞儀、SELEX技術與ELISA的聯合應用,更是極大的提升了篩選的效率和準確性。

2. 1消減SELEX技術

消減SELEX技術是一種經過改良的SELEX技術。以完整細胞為靶標的消減SELEX技術,是在篩選過程中以完整的細胞作為靶標,并消減掉能與已知或未知的共有靶標結合的配體,經過消減后的次級隨機文庫再投入到特異靶標的篩選中。它的意義在于可以實現從兩組高度同源的完整細胞中,篩選出針對其中一種細胞的特異性適配體。這項技術可應用于發現新的腫瘤細胞識別結構,還可進一步作為生物導彈,獨立完成靶向治療或攜帶藥物,未來將會在腫瘤的治療中發揮巨大的功效。

2. 2自動化SELEX技術

傳統的SELEX技術過程需要完成一套重復繁瑣的操作,使得篩選相對耗時耗力。自動化SELEX技術的建立可以簡化篩選過程,節約時間和物品的消耗,實現高通量和限定范圍,達到同時篩選多個靶分子的效果。自動化SELEX技術離不開現代分離儀器的配合,后者的發展推動了前者的進步。2001年等使用Biome 2000自動化工作站成功篩選到了溶菌酶的特異性適配體,通過這種自動化篩選平臺,不到2d就完成了12輪的篩選。

2. 3導向SELEX技術

適配體的特異性是整個SELEX技術的核心所在,為了提高適配體的特異性和穩定性,可將已知的能與靶標非特異結合的分子摻入到文庫中或預先與靶標進行混合后再篩選,這樣可獲得只與靶標特異結合的適配體。2002年Hamm等將此技術與抗個體基因型的方法聯合運用,成功獲得了特定激酶抑制劑的特異性RNA適配體。Martell運用特殊的導向SELEX技術,從隨機表達盒雜交文庫中篩選到了能與E2F蛋白具有高親和性的RNA適配體。

3 SELEX技術在醫學中的應用

3. 1 SELEX技術在基礎醫學研究中的應用

依據核酸適配體具有與靶物質高特異性結合的能力,可以幫助我們尋找到疾病的發病機制。Roulette等提出把SELEX技術同基因表達串行分析手段聯合應用,并通過自動化的序列提取工藝,建立轉錄因子結合位點的定位模型。通過對轉錄因子適配體文庫中的某一序列進行測序,可了解該蛋白結合位點的特異性,探尋一些以前在基因組中從未研究過的結合位點,掌握在不同的核苷酸位點上非獨立堿基出現的先后順序,為闡明其結合機制提供一些線索等采取SELEX技術發現,TRF1二聚體在端粒上有兩個相同的識別半位點,它們的距離可以變化,且兩個半位點的順序方向沒有區別。這為探索端粒長度的調節機制提供了新依據。

3. 2 SELEX技術在疾病診斷中的應用

腫瘤細胞及其標志物的早期檢測對于腫瘤的診斷及預后極為重要,目前已經篩選出多種腫瘤的特異性適配體,例如急性髓系白血病的適配體,急性淋巴細胞白血病的適配體、、惡性膠質瘤的適配體淋巴瘤的適配體TDOS、非小細胞肺癌的適配體、小細胞肺癌的適配體、乳腺癌的適配體、結腸癌的適配體、小鼠肝癌的適配體、卵巢癌的適配體。它們可以特異地識別腫瘤細胞,僅需少量腫瘤細胞即可實現準確的鑒別和分型。將適配體與納米顆粒結合后通過比色檢測,觀察顏色的變化即可判斷有無靶標細胞。這個實驗非常敏感,樣本中的靶細胞數超過百個即可檢測出來,還不需要昂貴的檢測設備和待檢靶標的標記與修飾。因此,有可能成為常規篩查活體標本中新生腫瘤細胞的一種新方案。與此同時腫瘤細胞的分子成像技術也已經問世,它能夠從細胞水平對生物過程進行可視化描述及測量,不僅能定位病灶,觀察某些影響腫瘤細胞行為的生物過程,還能觀察腫瘤細胞對藥物的反應。Kim等研究將前列腺特異性膜抗原(PSMA)的特異性適配體與金納米材料結合后,帶有PSMA的前列腺癌細胞便能夠被特異性地標記出來,將其作為造影劑應用在前列腺腫瘤的影像學診斷中,比傳統的造影劑顯像時間更持久,毒副作用更小,應用價值更顯著。

SELEX技術還在血液的生化檢查方面,顯示出一定的應用前景。用其檢測血液中的某些靶分子,將比傳統方法更特異和高效。腦尿鈉膚(BNP)常被臨床上用來評價急性心力衰竭或急性呼吸窘迫癥患者的病情和預后。Lin等采用SELEX技術的原理,篩選到了能與BNP特異結合的適配體。在微流體試驗模式下,被熒光標記的適配體可以快速測出血液中BNP的濃度,比放射免疫分析法或是免疫分析技術更精確、更經濟。反應蛋白(CRP)是機體在應激狀態下生成的一種非特異性的急性時相反應蛋白,CRP與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病具相關性。Bin等開發出了一種帶有光化學性質的CRP特異性適配體,當血液中的CRP濃度超0.005mg/L時就能被檢測出來,敏感度非常高。這一成果為新型CRP診斷試劑的研制奠定了基礎。

SELEX技術還被應用在病原微生物的檢測,其能克服傳統檢測方法在特異性和敏感性上的缺陷,為新型檢測試劑盒的開發提供有力支持。例如結合分支桿菌的特異性適配體CSRI 2. 11檢測過程比傳統的培養鑒定法更省時更敏感;丙型肝炎病毒的適配體ZE2可結合酶聯免疫吸附試驗實現丙型肝炎的早期篩查,不受抗體檢測時窗口期的制約;瘧原蟲乳酸脫氫酶的適配體PL1在臨床實踐中,可以很好的區分患者是否感染了出間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲。

3. 3 SELEX技術在疾病治療中的應用

SELEX技術在疾病治療中的功效越來越來受到人們的重視。適配體在體內與靶分子結合,理論上可以對靶分子的生理功能和代謝過程產生影響,靶分子也會因此發生信號傳導的改變甚至喪失原本的功能,直接或間接阻斷疾病發生進程。以此開發的靶蛋白功能阻斷劑,日益顯示出其巨大的潛力。全球首個適配體藥物是2004年由美國食品和藥物管理局批準上市的呱加他尼鈉,可用來治療老年性黃斑變性。

SELEX技術在凝血系統疾病的治療上具有一定的意義,已找到了可用作抗凝血和抗血栓藥物的適配體,其結合的位點是凝血酶的肝素結合位點以及纖維蛋白原結合位點。在治療免疫系統疾病方面,也已獲得了具有藥物開發潛力的特異性適配體,如可用來拮抗自身抗體已達到治療系統性紅斑狼瘡的適配體,還有能刺激T細胞釋放的適配體。對于腫瘤的治療,基于SELEX技術研制的適配體藥物更是走在前列,進入到了臨床試驗階段。如對實體瘤和復發性急性髓樣白血病有良好療效的AS1411,更出現了連接金納米棒的適配體,用作腫瘤靶向光熱治療回。適配體藥物作為抗病毒藥,也展現出良好的前景,比如用來抑制狂犬病病毒的復制和干擾艾滋病病毒的體內合成。除此以外,核酸適配體還可作為運輸工具,特異性地把藥物運送至靶標細胞或組織達到定點清除的治療效果,研究比較成熟的有裝載著阿霉素,用來殺傷前列腺癌細胞的復合適配體藥物。

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